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            谷氨酸脫氫酶(Glutamate Dehydrogenase)的活性檢測方法

            1. 目的

            本程序是為了建立谷氨酸脫氫酶(Glutamate Dehydrogenase)的活性檢測方法,適用于GLDH成品的活性檢測。

            2. 范圍

              適用于GLDH成品、半成品及其他樣品的檢測。

            4. 定義

               U: 在pH7.3, 37度的環境下, 每分鐘轉化1umolα-酮戊二酸變成L-谷氨酸所需要的酶量。

               活性: 每毫升樣品中的活性值。

               比活: 每毫克蛋白的活性值。

            5. 內容

            5.1原理

            α-Ketoglutarate + NH3 + NADH + H+        L-Glutamate+ NAD+ +H2O

            NADH的消耗可以通過340nm的光吸收進行檢測。

            5.2試劑:

            A  0.1 M Tris-HCl 緩沖液, pH 8.3

            B  1.5M NH4Cl溶液

            C  0.225M α-酮戊二酸溶液(pH 7.0-9.0)

            D  7.5mM NADH溶液

            E   酶稀釋液: 0.1 M Tris-HCl 緩沖液, pH 8.3

            試劑的配制方法詳見各試劑配制記錄,配制人員需完整填寫配制記錄。

            5.3 操作規程:

            5.3.1儀器參數設定

            若儀器中無已保存參數,按以下參數設定。若已有相關參數,調取后確認。

            檢測方法:動力學掃描

            測量波長:340nm         測量時間:180s

            延遲時間:60s            積分時間:120s

            系數/因子:6.776          測量溫度:30±1℃

            5.3.2 樣品準備

            若待測樣品為固體,可以按10mg 樣品/1000ul 超純水比例溶解。溶解后于2-8度放置30min。

            5.3.3 檢測方法

            5.3.3.1 在石英比色皿中加入2.5ml 試劑A, 200ul試劑B,100ul 試劑C, 100ul D于30度孵育2min。

            5.3.3.2 加入50ul 樣品后, 溫和混勻后開始測定。

            5.3.3.3 測定結束后,記錄相應數值:起始讀數、△A/min test、活性值(U/ml)。

            5.3.3.4 活性值(U/ml)范圍為0.1-0.3U/ml,若超出范圍,待測樣品需經試劑D稀釋后再次進行檢測。

            5.3.3.5測定樣品前需檢測空白反應值,即其他操作不變,用500ul E代替樣品加入比色皿后進行反應,測定△A/min blank。

            5.3.3.6計算公式  活性(U/ml) =(△A/min test-△A/min blank)×6.776×df (稀釋倍數)

            5.4 成品檢測結果精密度要求:每個樣品檢測時,在線性范圍內選擇三個不同的稀釋度進行測定,得到的原液/粉末活性,計算Cv值,Cv值得要求為<5%,達到要求后,此次測定的結果認為有效, 取三個檢測數值的平均數作為最終的檢測數值。若不能達到,對此三個稀釋應進行重新檢測。

            此方法僅作為參考!

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